The dynamics of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis: exploring the biological basis of multi- and extensively drug resistant tuberculosis (MDR/XDRTB) as a route for alternative therapeutic strategies

Mycobacterium tuberculosis strains with multi- or extensive drug resistance are a major threat for human health. The main objective of this thesis was to understand the basis of the development of resistance in M. tuberculosis, in order to design strategies to circumvent its development.
First we started with the description of the molecular basis of drug resistance in M. tuberculosis clinical strains circulating in Lisbon through the determination of their resistance patterns and its correlation with mutations associated with resistance. The results showed a clear correlation between the presence of conserved mutation and the resistance phenotype. The description of the resistance profiles of drug resistant strains adds new knowledge for the design of more effective tools for the diagnosis, treatment and management of tuberculosis.
Next, was investigated the contribution of efflux to the emergence of drug resistance in M. tuberculosis. The study was based on the in vitro induction of an isoniazid resistant phenotype by prolonged serial exposure of M. tuberculosis strains to the critical concentration of isoniazid. The results showed that the increased activity of efflux pumps allows a sustainable resistant population to be maintained in the patient under therapy, from which genetically resistant mutants will emerge. The addition of an efflux inhibitor is able to reduce this level of resistance.
Finally, the mechanism of action of the ion channel blockers and inhibitors, verapamil, thioridazine, chlorpromazine, flupenthixol and haloperidol, was evaluated both in vitro and ex vivo. All compounds exhibit synergistic inhibitory activities when combined with the main first line antituberculosis drugs, demonstrating their role as efflux inhibitors and displaying rapid and high killing activity that could be correlated with a decrease in intracellular ATP levels. Overexpression of efflux genes was detected in response to antibiotics in vitro and ex vivo, indicating that drug resistance within macrophages is also mediated by the expression of efflux pumps that can be inhibited. The compounds lead to a decrease in the intracellular mycobacterial load as a result of their ability to induce phagosome acidification with consequent expression of lysosomal hydrolases. We hypothesized that these compounds inhibit the mycobacterial respiratory chain which leads to the dissipation of membrane potential, depletion of ATP, reactive oxygen species generation and cell death. Disruption of the proton motive force (PMF), results in the inhibition of PMF-dependent efflux systems, therefore promoting the retention of antibiotics subject to active efflux. Concerning the host cell, the phagosomal acidification stimulated by these compounds synergize with several components of the host immune response, restricting M. tuberculosis intracellular growth. Altogether, we demonstrate that the compounds display a dual inhibitory effect as they target both the bacteria and the host cell.
This thesis aims to contribute to the knowledge on M. tuberculosis drug resistance mechanisms. The understanding of the activity of the studied compounds will contribute for the design of new drugs and can provide the basis for the development of new therapeutic strategies to fight drug resistant tuberculosis.


Estirpes de Mycobacterium tuberculosis multi- e extensivamente resistentes, constituem uma ameaça para a saúde humana. O principal objectivo desta Tese foi estudar os fenómenos subjacentes ao desenvolvimento da resistência em M. tuberculosis, de modo a ser possível desenvolver estratégias para reduzir o seu desenvolvimento.
Iniciamos o estudo com a descrição da base molecular da resistência aos antibacilares em estirpes clinicas de M. tuberculosis circulantes em Lisboa, através da determinação dos seus padrões de resistência e sua correlação com as mutações associadas à resistência. Os resultados mostraram uma clara correlação entre a presença de uma mutação e o fenótipo de resistência. A descrição dos perfis de resistência de estirpes resistentes aos antibacilares adiciona nova informação para o desenvolvimento de metodologias mais eficazes para o diagnóstico e tratamento da tuberculose.
De seguida, avaliamos a contribuição dos sistemas de efluxo para o desenvolvimento da resistência aos antibacilares em M. tuberculosis. O estudo baseou-se na indução in vitro de um fenótipo de resistência à isoniazida por exposição prolongada de estirpes de M. tuberculosis à concentração crítica de isoniazida. Os resultados mostraram que o aumento da actividade de bombas de efluxo permite a manutenção de uma população resistente num doente em tratamento, da qual irão emergir mutantes geneticamente resistentes. A utilização de compostos inibidores de efluxo demonstrou ser capaz de reduzir este nível de resistência.
Por último estudamos o mecanismo de acção dos compostos inibidores do efluxo, que partilham a característica comum de serem inibidores de canais iónicos, verapamil, tioridazina, clorpromazina, flupentixol e haloperidol, quer in vitro quer ex vivo. Todos os compostos apresentaram actividade sinérgica inibitória em combinação com os principais antibacilares de primeira linha e foram capazes de inibir o efluxo activo demonstrando o seu papel como inibidores de efluxo. Igualmente demostraram potente actividade bactericida que pôde ser correlacionada com a diminuição nos níveis de ATP intracelulares. Foi também detectada sobrexpressão de genes de efluxo em resposta à exposição aos antibióticos in vitro e ex vivo, indicando que a resistência aos antibióticos em macrófagos é também mediada pela sobrexpressão de bombas de efluxo, a qual pode ser inibida por inibidores de efluxo. Os compostos estudados potenciaram a actividade antimicrobiana de macrófagos infectados e induziram a acidificação do fagolisosoma, com consequente expressão de hidrolases lisossomais. Com estes resultados, foi possível propor, como mecanismo de acção para estes compostos, a inibição da cadeia respiratória micobacteriana. Esta inibição leva à dissipação do potencial de membrana, depleção de ATP, a produção de radicais de oxigénio e morte celular. Por outro lado, e em simultâneo, a disrupção da força motriz protónica (PMF) resulta na inibição dos sistemas de efluxo que dela dependem, promovendo assim a retenção dos antibióticos sujeitos a efluxo activo. No que se refere a célula hospedeira, a acidificação phagosomal estimulada por estes compostos actua em sinergismo com vários componentes da resposta imunitária do hospedeiro, restringindo assim o crescimento intracelular de M. tuberculosis. No contexto geral, demonstramos que estes compostos possuem dupla acção, uma vez que actuam quer na bactéria quer na célula hospedeira.
Este trabalho contribuiu para o aumento do conhecimento sobre a resistência aos antibióticos em M. tuberculosis. O estudo do mecanismo de acção destes compostos poderá contribuir para o desenvolvimento de novos compostos e pode servir de base para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para combater a tuberculose e em particular as suas formas multirresistentes.