Detecção rápida de polimorfismos de nucleotídeo único em parasitas Plasmodium falciparum resistentes aos medicamentos antimaláricos através da amplificação isotérmica de ácidos nucleicos

Introdução: Apesar dos esforços para reduzir a transmissão da malária globalmente, poucos progressos foram alcançados na última década. A resistência aos antimaláricos é reconhecida como um dos principais obstáculos ao controlo da malária, estando os principais fatores de resistência associados a polimorfismos de nucleotídeo único [do inglês“single nucleotide polymorphism“ (SNPs)]. A falta de tecnologias de diagnóstico rápidas, fiáveis e simples para detetar parasitas Plasmodium resistentes é um dos principais motivos da propagação dos mesmos. Objetivo (s): O nosso objetivo é desenvolver um biossensor rápido, fiável, simples e portátil que utilize uma abordagem de amplificação isotérmica baseada na polimerase recombinase [do inglês “recombinase polymerase amplification”(RPA)] para a deteção de SNPs associados à resistência dos parasitas Plasmodium falciparum aos antifolatos, como a sulfadoxina-pirimetamina, medicação uitilizada amplamente na prevenção da malária em áreas endémicas em crianças e gestantes.
Material e Métodos: Os seguintes materiais e métodos têm sido utilizados e desenvolvidos, respectivamente: i) Seleção de SNPs de interesse, tais como N51I, C59R e S108N localizados nos gene pfdhfr e A437G e K540E no gene pfdhps, associados à resistência a pirimetamina e sulfadoxina, respectivamente, ii) Desenho e síntese de pares de oligonucleotídeos complementares e ácido desoxiribunucleico de cadeia única (do inglês DNA) idêntico às regiões génicas de interesse, com e sem o SNP, iii) Ensaios de otimização com o material sintetizado de modo a estabelecer o melhor protocolo. Com o protocolo estabelecido, iv) ensaios com DNA de clones de P. falciparum contendo os SNPs de interesse, cultivados in vitro, e, v) ensaios com DNA de isolados de campo de P. falciparum oriundos da Guiné Equatorial, previamente caracterizados para os SNPs de interesse através de protocolos clássicos de genotipagem molecular, serão realizados de modo a validar a nova metodologia e comparar a sua eficácia com esses protocolos. Resultados e Conclusão: Estamos a otimizar o protocolo, enquanto avaliamos a especificidade da amplificação em ensaios de reatividade cruzada em fase líquida. Determinamos a temperatura e o tempo de reação que amplifica com sucesso os DNAs-alvo relativos aos SNPs que conferem resistência à pirimetamina. Efetuamos diluições seriadas dos DNAs-alvo e
determinarmos a concentração de DNA, para a qual se obtém amplificação específica a uma temperatura e tempo de reação comuns.