A peroxidase do citocromo c de Marinobacter hydrocarbonoclasticus 617: aplicação de técnicas espectroscópicas e electroquímicas ao estudo do mecanismo de activação e catálise

As peroxidases do citocromo c bacterianas catalisam a redução do peróxido de hidrogénio a água. A sua estrutura, activação e os mecanismos de desintoxicação de peróxido de hidrogénio tem sido alvo de estudos desde os anos noventa do século XX. Estas enzimas existem numa grande variedade de organismos, tanto aeróbios como anaeróbios e protegem-os do stress oxidativo. Este trabalho teve como principal objectivo o aprofundamento do conhecimento do mecanismo de activação e catálise da peroxidase do citocromo c (PCc) da bactéria marinha Ma. hydrocarbonoclasticus. Pretendeu-se compreender melhor os factores de que depende a activação da enzima, e que alterações estruturais provocam. Também se pretendeu conhecer melhor os mecanismos que regem a transferência de electrões no meio biológico, tendo-se centrado este estudo na transferência de electrões entre a PCc e o seu parceiro fisiológico o citocromo c552. Analisou-se o comportamento electroquímico da PCc com eléctrodos com filme de proteína e de membrana e utilizaram-se técnicas espectroscópicas.
Iniciou-se o trabalho investigando as condições que permitem à bactéria Ma. hydrocarbonoclasticus, sobreexpressar a peroxidase do citocromo c. Esta optimização permitiu confirmar que o FNR regula a expressão do gene ccp que codifica para esta enzima. Caracterizou-se a PCc e investigou-se o seu mecanismo de activação, o qual exibe características de efeito redox-Bohr. Estudou-se também a cinética da transferência electrónica intermolecular durante a catálise da peroxidase do citocromo c mediada pelo citocromo c552, obtendo-se uma constante intermolecular, k, de (8,00,4)  106 M-1 s -1. Investigou-se ainda a influência de condições experimentais como o pH ou a força iónica na catálise mediada. Os resultados obtidos nas diferentes condições foram analisados com base em parâmetros termodinâmicos e cinéticos, tais como potenciais formais e constantes de velocidades de
transferência intermolecular. Usando técnicas electroquímicas obteve-se um pKa1 de 5,80,1 e um pKa2 de 7,50,1, usando técnicas espectroscópicas pKa1 de 5,50,1 e um pKa2 de 8,50,1. Esta diferença de resultados foi atribuída às diferentes condições experimentais iniciais usadas em cada técnica. A análise dos resultados do estudo da actividade catalítica com a força iónica mostrou que o complexo entre a PCc e o citocromo c552 tem natureza hidrofóbica. Com base nas estruturas da PCc e do citocromo c552 de Ma. hydrocarbonoclasticus, usando o algoritmo computacional BiGGER e o programa Chemera, bem como dados de espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear, propôs-se uma estrutura para o complexo de transferência electrónica entre as duas proteínas.